近期武漢生物制品研究所與國家聯合疫苗工程技術研究中心等團隊在《中國生物制品學雜志》發表關于多類型生物反應器培養Vero細胞制備病毒的成果比較，該研究為不同類型生物反應器培養Vero細胞制備病毒，以及放大培養提供了技術支持，為后期更大規模攪拌式生物反應器高密度貼壁細胞培養病毒奠定基礎。
目的：
比較攪拌式生物反應器、籃式生物反應器和搖床生物反應器培養Vero細胞制備柯薩奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)的效果。
方法：
分別采用2L搖床生物反應器(預輻照片狀載體袋)、15L籃式生物反應器(片狀載體)和40L攪拌式生物反應器(球狀載體)培養Vero細胞，制備CV-A10，比較不同類型生物反應器細胞貼壁效率、營養代謝物質含量、細胞生長特性以及病毒滴度和抗原含量差異。
結果：
攪拌式生物反應器僅需適當攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細胞的充分混勻。攪拌式生物反應器，搖床生物反應器、籃式生物反應器均可用于Vero細胞的穩定培養和CV-A10的高效制備，其中攪拌式生物反應器培養時間短，病毒滴度更高。
01 背景
生物反應器是模擬細胞的體內環境并在體外進行生物培養的系統，其能實現細胞在體外的高密度增長，高效地產出具有醫藥價值的酶、單抗、疫苗等目標產物。動物細胞無細胞壁，對剪切力非常敏感，為避免細胞損傷，通常需要對生物反應器進行一定改進，如改進攪拌槳、供氣方式、加裝輔件等，從而優化細胞生長環境。生物反應器培養過程及培養方式具有復雜性，不同類型的生物反應器和生物反應器培養過程參數均會對細胞生長和病毒增殖產生影響。該研究基于Vero細胞和CV-A10，比較搖床生物反應器(預輻照片狀載體袋)、籃式生物反應器(片狀載體)和攪拌式生物反應器(球狀載體)培養Vero細胞和CV-A10的差異性，以期建立Vero細胞和CV-A10高密度、高產量培養方法，為開發包含CV-A10的HFMD多價滅活疫苗提供工藝數據支持。
02 結果
2.1不同類型生物反應器細胞貼壁效率
攪拌式生物反應器接種細胞后0.5、1.5、2.5和3.5 h，上清中游離細胞占比分別為68.33%、57.00%、48.00%和30.00%，接種細胞后3.5 h，上清中有30.00%細胞未貼附至球狀載體上面，見圖1
圖1細胞貼壁效率曲線
2.2不同類型生物反應器營養代謝物質含量
不同類型生物反應器細胞培養過程中，葡萄糖含量變化曲線基本保持一致，均呈先下降后上升趨勢。不同類型生物反應器細胞培養過程中，乳酸含量變化曲線基本保持一致，均呈先上升后下降趨勢，細胞培養第3～4天時，乳酸含量最高，見圖2。
圖2葡萄糖（A）和乳酸（B）含量變化曲線
2.3不同類型生物反應器細胞生長特性
Vero細胞在2L搖床生物反應器和40L攪拌式生物反應器的細胞生長曲線均呈S型。
2L搖床生物反應器、15L籃式生物反應器與40L 攪拌式生物反應器病毒收獲液抗原含量分別為2 899～5 341、3 932～6 086和3 322～4 262 U/mL。
2L搖床生物反應器、15L籃式生物反應器和40L 攪拌式生物反應器病毒收獲液病毒滴度分別為7.750～8.500、7.875～8.250和8.375～9.000 lg CCID50/mL。
攪拌式生物反應器培養時間短，病毒滴度高，這主要是因為攪拌式生物反應器僅需適當攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細胞的充分混勻。2L搖床生物反應和15L籃式生物反應器由于片狀載體傳質交換較弱，接種或細胞釋放的病毒與片狀載體內腔空隙結構生長的Vero細胞的混勻效果較差。此外，相比于球狀載體，片狀載體由于傳質效果更差，載體中殘留病毒量可能更多。球狀載體培養的細胞更易由于球狀載體間的相互碰撞，受感染的細胞更脆弱，病毒能更快地從感染細胞中釋放出來。
圖3C：40L攪拌式生物反應器細胞形態（× 100）
03 討論
在攪拌式生物反應器中，球狀載體貼壁120min后，貼壁效率能達到約90%。該研究中，攪拌式生物反應器培養時間短，病毒滴度高，攪拌式生物反應器僅需適當攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細胞的充分混勻。此外，相比于球狀載體，片狀載體由于傳質效果更差，載體中殘留病毒量可能更多。球狀載體培養的細胞更易由于球狀載體間的相互碰撞，受感染的細胞更脆弱，病毒能更快地從感染細胞中釋放出來。說明攪拌式生物反應器球狀載體培養同樣能用于CV-A10的穩定、高效生產，在未來對攪拌式生物反應器不斷地工藝優化中，可以實現更好的產量。
該研究將進一步提高培養效率，加快應對突發傳染病疫苗研發的速度。Vero細胞和CV-A10在攪拌式生物反應器中的成功放大，為其在包括CV-A10的HFMD多價滅活疫苗和未來新發突發傳染病疫苗中的應用提供了數據支持。
應用攪拌式生物反應器培養Vero細胞是病毒制備的關鍵技術，是重要的發展方向之一。生物反應器易操控，適合規模化放大，應用攪拌式反應器球狀載體培養Vero細胞具有明顯優勢。生物反應器培養可獲得更高的收益率，生物反應器的控制系統可以完成更多工作，可監測和控制的參數數量基于生物反應器中的傳感器和控制元件數量，可以更好的進行培養工藝條件的篩選，優化。工藝簡單、操作靈活，有良好的適用性；培養工藝容易放大，可為生物體生長和增殖提供均質的環境；產品質量穩定，適合工業化生產；提供較好的無菌條件，細胞生長過程中不易污染。
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本文章轉載至《中國生物制品學雜志》
DOI：10.13200/j.cnki.cjb.004309
